Техника - молодёжи 1999-06, страница 25

Молекулы рестриктазы химически связываются с ними и в этих местах рвут цепь ДНК.

Имеются сравнительно простые методы измерения длин участков, на которые порезала молекулу ДНК рестриктаза. Любое изменение сайта узнавания ведет к тому, что тот становится «невидимым» для фермента. А значит, ДНК разрезается в других местах и образуются иные по длине фрагменты.

Чем хорош метод картирования по генетическому сцеплению — его можно применять, не имея ни малейшего представления о структуре генов тех или иных признаков. Достаточно уверенности, что таковые гены есть, а дальнейшие мероприятия направлены на то, чтобы узнать, ГДЕ они, а не КАКИЕ они.

Недостатки метода — довольно низкая разрешающая способность (7—10 Мб) и высокая трудоемкость. Кроме того, ген на карте предстает не протяженным отрезком ДНК (каков он «на местности»), а точкой на линии, изображающей ее двойную цепь.

Наконец, к великому сожалению, человек — не дрозофила. Очень легко считать частоту рекомбинации маркеров, скрещивая мелких мушек тысячами и десятками тысяч. А с Homo sapiens такой способ по понятным причинам не годится, и о частоте рекомбинации приходится судить по статистическим данным — скажем, по заболеваемости таким-то наследственным недугом в стольких-то семьях за столько-то десятилетий (а то и веков). Кстати, именно генетическое картирование помогло найти точное расположение на хромосомах генов многих тяжелых наследственных болезней — муковисцидоза, серповидно-клеточной анемии, хореи Ген-тингтона, болезни Тея — Сакса, поликистоза почек, миотонической дистрофии и других.

МЕЛКОМАСШТАБНЫЕ ФИЗИЧЕСКИЕ КАРТЫ

К ним относят хромосомные и карты кДНК («к» значит «кодирующей»).

Хромосомное картирование довольно грубо, но имеет смысл, когда нужный ген держат, что называется, в руках: известна его структура, он химически выделен, но неизвестно, где он «сидит». Тогда хромосомы, извлеченные из ядра клетки во время ее деления (когда они толстые и хорошо различимые), обрабатывают особыми кра-

Форма представления карты генома при разных методах картирования: а — карта генетического сцепления; б — участок хромосомы, «составленный» из последовательности макрорестрикционных карт; в — геномная библиотека, упорядоченная путем картирования контиг; г — последовательность нуклеотидов, прочитанная секвенированием.

Форма представления карты генома при разных методах картирования: а — карта генетического сцепления; б — участок хромосомы, «составленный» из последовательности макрорестрикционных карт; в — геномная библиотека, упорядоченная путем картирования контиг; г — последовательность нуклеотидов, прочитанная секвенированием.

сителями, придающими им «полосатость»: получаются так называемые бэнды — раз-ноокрашенные участки хромосом. Искомый ген размножают в пробирке и при этом метят его копии, подменяя, например, водород тритием. За таким радиоактивным зондом очень удобно следить: если подмешать его к препарату хромосом и выдержать некоторое время, он химически свяжется с определенным бэндом определенной хромосомы, встав «на свое место» (это называется «гибридизация in situ», т.е. «на месте»). Так были картированы гены альбумина, коллагена, гормона роста и некоторые другие Средний размер бэнда — около 10 Мб: такова и точность хромосомной карты. Правда, позднейшее усовершенствование — гибридизация с флуоресцентной меткой (FISH — fluorescent in situ hybridization) — повысило разрешение до 5 — 2 Мб. Более того, разработан даже метод гибридизации меченых генов с хромосомами, извлеченными из ядра неделящейся клетки — и значит, деконден-сированными, «развинченными», а не упакованными в компактные образования. В итоге удалось локализовать участки до 0,1 Мб.

Карты кДНК отражают расположение экспрессирующихся нуклеотидных последовательностей. По-русски это означает следующее. Допустим, в клетке активно работает, производя белок, некий ген. Что за ген — неизвестно Где он — тоже. Тогда пользуются тем обстоятельством, что при синтезе белка в клеточном ядре сначала «штампуются» молекулы мРНК — точные копии работающего гена («м» — матричные). Сей промежуточный продукт можно выловить из клетки и размножить в пробирке, пометив тритием либо радиоактивным фосфором (см. выше). А дальше все как при хромосомном картировании: зонд пристроился к участку N — значит, экспрессия шла здесь и, следовательно, здесь расположен ген, кодирующий данный белок.

КРУПНОМАСШТАБНЫЕ КАРТЫ ГЕНОМА

Их составляют по общему принципу: сначала кромсают ДНК на куски, разгоняют получившиеся фрагменты в электрическом поле (электрофорез) и затем гибридизуют с меченым зондом. В результате фрагменты упорядочиваются — воссоздается их ис-

Секвенирование ДНК: а — разгонка ее фрагментов в полиакриламид -ном геле (для каждой из четырех реакций на определенный «лишний» нуклеотид); б — чтение последовательности нуклеотидов снизу вверх: каждый фрагмент ДНК разместился в «своем» столбце, соответственно тому, на какой нуклеотид он отличается от соседнего фрагмента.

ходная последовательность. Для этого используют разные методы поиска перекрывающихся участков.

В любом случае необходимо прежде всего получить фрагменты ДНК картируемого участка в больших количествах. ДНК размножают обычно двумя способами — клонированием и ПЦР.

КЛОНИРОВАНИЕ — по современным понятиям сравнительно примитивный метод. Последовательность действий такова: порезали рестриктазой изучаемый участок ДНК — вставили каждый ее отрезок в молекулу вектора (бактериальной, дрожжевой или другой кольцевой ДНК), разрезанную в одной точке той же рестриктазой: получилась рекомбинантная кольцевая ДНК с «чужой» вставкой. Такую смешанную ДНК «вселяют» в ядро клетки-хозяина (обычно бактерии), и та принимается делиться в культуре, благодаря чему рекомбинантная ДНК — и.о. ее генома — размножается практически до любого количества копий. Результат — набор клонов разных фрагментов картируемой ДНК, или, как его обычно называют, библиотека клонов.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) — лабораторный синтез фрагментов ДНК без клетки-хозяина В пробирку к фрагменту, который надо размножить, «подсаживают»: а) фермент ДНК-полимеразу, который осуществляет воспроизведение ДНК в живых клетках; б) стройматериал, т.е. отдельные ну-клеотиды; в) праймеры — короткие цепочки нуклеотидов, соответствующие концам размножаемого фрагмента. (Тут, как видите, слабое место метода: про упомянутый участок надо кое-что знать заранее — а именно структуру праймеров...) Затем пробирку нагревают — фрагмент от жары «расклеивается», разделяясь на две цепи (надеемся, читатель не забыл, что ДНК — двойная спираль?); пробирку охлаждают — праймеры присоединяются к концам фрагмента и полимераза начинает свое дело. Чередуя нагревания и охлаждения, можно за полтора часа довести количество копий нужного участка ДНК до нескольких миллионов — в чем и состоит главное преимущество ПЦР перед клонированием. Но у нее есть два недостатка. Один уже упомянут — нужно знать праймеры «в лицо», иначе реакцию не удастся запустить. Второй — техническая невозможность копировать фрагменты длиннее 5 — 6 тысяч п.н.

После того как все фрагменты ДНК получены в достаточном количестве копий, их упорядочивают, для чего сперва разделяют электрофорезом, а затем химически связывают (гибридизуют) с меченым зондом, чтобы каждый фрагмент встал на свое место и, так сказать, просигналил о себе: вот он я!

Крупномасштабные физические карты генома бывают двух типов. Первый — МАКРОРЕСТРИКЦИОННЫЕ (по принципу «сверху вниз»): ДНК режут редкощепящей рестриктазой на крупные куски, упорядочивают их, потом делят на более мелкие, которые тоже упорядочивают. Такая карта охватывает довольно большие участки генома — до 10 Мб — и не содержит пробелов. Но ее разрешение сравнительно невелико — от 1 Мб до 100 кб.

Гораздо выше точность у КАРТ КОНТИГ Их строят по обратному принципу — «снизу вверх». Хромосому шинкуют на очень короткие фрагменты, размножают их и упорядочивают.

Окончание на с. 34.

ТЕХНИКА-МОЛОДЕЖИ

25

6 9 9