Тело человека №108, страница 14

ПАТОЛОГИЯ: Клиническая биохимия

Принципы ПЦР

Первым шагом ПЦР-диагно-стики является определение точной последовательности оснований в выбранном гене. Реплицируется его наиболее информативная последовательность, которая называется ДНК-мишенью.

ПРАЙМ ЕРЫ Следующим шагом является поиск коротких последовательностей нуклеотидов, которые определяют начало и конец мишени. Создаются два небольших отрезка синтетической ДНК (праймеры), которые соответствуют нуклеотидным последоватепьностям по обеим сторонам от «мишени».

▼ Перед использованием ПЦР в качестве вспомогательного средства диагностики необходимо получить ДНК пациента. Она может быть получена из ткани, межтканевой жидкости или, как на фото, из крови.

ДНК, полученная из небольшого количества крови, ткани или межтканевой жидкости, добавляется в раствор,содержащий праймеры, большое количество нуклеотидных строительных блоков (А, Т, Ц, Г) и полимеразный фермент. Полимеразу, как правило, получают из термофильных (теплолюбивых) бактерий. В ПЦР широко используется полимераза Taq-1, полученная из бактерии вида Thermus aquaticus.

Вся смесь подвергается нескольким циклам нагрева и охлаждения, в ходе которых вопроизводится большое количество копий ДНК-мишени.

ЭТАПЫ ПЦР Этот процесс, как правило, осуществляется в аппарате под названием термоциклер. Репликация проходит в три этапа:

1. Денатурация при 95 °С -при этой температуре разделяется двойная спираль ДНК.

2. Отжиг при 52 °С - праймеры примыкают к соответствующим последовательностям наряду с ДНК-мишенью.

3. Элонгация (синтез) при 72 °С - это оптимальная температура для бактериальной полимеразы, при которой происходит добавление основания к концу каждого прай-мера и создается новый короткий фрагмент ДНК -копия ДНК-мишени.

После стадии синтеза температура вновь повышается, и цикл повторяется вновь. Праймеры отделяются от цепочек ДНК, и при более высокой температуре полимераза становится неактивной. В результате 30 циклов производится 1 073 741 824 новые копии ДНК-мишени.

Последней стадией в этом процессе является визуализация, или обнаружение

Применение ПЦР

ПЦР является высокочувствительным методом, позволяющим осуществлять репликацию ДНК в достаточном количестве для генетического анализа. ПЦР имеет следующие области применения.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ Некоторые заболевания вызваны мутацией в единственном гене. Муковисцидоз, например,

вызван мутациеи в гене, известном как CFTR. ПЦР можно использовать для диагностики этого заболевания или выявления носителей аномального гена.

Пренатальная диагностика в семьях, где есть дети с генетическими отклонениями, дает родителям возможность прервать беременность при обнаружении мутации.

Другие гены могут обуславливать предрасположенность к раку. Мутации в генах BRCA1 и BRCA2 являются маркерами для женщин, входящих в группу риска развития наследственного рака молочной железы.

МИКРОБНЫЕ АГЕНТЫ Большинство инфекций может быть диагностировано

< Некоторые болезни являются результатом генетической мутации. С помочью ПЦР можно определить мутант в генах женимы с риском развития рака молочной железы.

А В этих пробирках содержится ДНК, полученная в результате ПЦР. Репликация происходила в три этапа.

новообразованной ДНК. Проще всего это можно сделать с помощью электрофореза, в процессе которого ДНК добавляется в гель, а затем подвергается воздействию электрического тока. Фрагменты ДНК движутся в геле с разной скоростью в зависимости от их размера.

При просмотре геля в ультрафиолетовом свете молекулы ДНК проявляются в виде полос, расположенных под прямым углом к направлению потока. Наличие полосы того же размера, что и ДНК-мишень, означает положительный результат теста. Амплифицированная ДНК может также быть обнаружена путем добавления фермента или люминесцентного маркера.

на основании клинических симптомов и результатах исследований, позволяющих выявить сам микроорганизм или реакцию на него иммунной системы.

Однако при некоторых состояниях, например ВИЧ или гепатит С, где между инфицированием и выявляемой реакцией проходит некоторый период времени, с помощью ПЦР можно обнаружить ядро вируса раньше, чем при других тестах.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ Успешность трансплантации костного мозга зависит от наличия донора, чей тип ткани, или HLA (лейкоцитарный антиген человека), наиболее близко совпадает с типом ткани реципиента. Тип HLA определяется маркерными белками на клеточной поверхности, которые до появления ДНК-методик определялись с помощью специально отобранных антител.

А Вирус ВИЧ, наблюдаемы* здесь под микроскопом. является основ-ным возбудителем СПИДа. ПЦР имеет неоценимое значение для ранней диагностики заболевании с длителыъм периодом инкубации.

Использование ПЦР для выявления генов, определяющих генетический код различных типов HLA, выявило огромный диапазон различий, которые невозможно было обнаружить с помощью традиционных методов.