Техника - молодёжи 1975-10, страница 6

сложны настолько, что к ее настоящему исследованию ученые смогли приступить сравнительно недавно

В начале XX века к мембране «прикоснулись», но только электронный микроскоп дал возможность ее увидеть. Ведь толщина мембран меньше длины световой волны, и поэтому их внутреннее строение нельзя изучать с помощью оптических микроскопов.

Следующий этап тоже требует сложнейших технических средств, необходимо выделить мембрану, сохранив при этом ее свойства. Способы получения фракций клеточной мембраны сейчас уже достаточно разработаны. Вот один из них. Клетки разрушают, воздействуя на них ультразвуком, быстро замораживая и размораживая ткань или взрывая их изнутри мгновенным понижением давления. Затем элементы разрушенной клетки отделяют друг от друга, используя для этого центрифугу. С помощью электронного микроскопа или других методов контроля определяют «чистоту» фракции, присутствие в ней примесей. Причем очень важно, чтобы после многочисленных процедур фракция не только не содержала примесей, но и не потеряла своих собственных важных химических компонентов.

Выяснено, что мембрана состоит из липидов (жиров), белков, углеводов, воды и неорганических ионов. Можно сказать, что мембраны представляют собой пленки из липидов толщиной в две молекулы. Что касается белков, то они как бы приклеены к этой пленке, либо погружены в нее одним из концов своих молекул, либо прошивают насквозь.

Чтобы увидеть мембраны в микроскопе, их обрабатывают особыми веществами — электронно-плотными красителями. Такие красители плохо окрашивают липиды, и на фотографиях они выглядят светлее, чем белки. К сожалению, под действием красителей мембраны могут изменять свое строение, поэтому интерпретация полученных фотографий — трудное дело.

Иногда мембраны называют «трехслойным пирогом», ибо под электронным микроскопом они выглядят как трехполосные ленты: две темные (белки) по краям и между ними одна светлая (липиды).

— А что же придает родопсину способность «улавливать» свет!

— Вот мы и вернулись к началу нашего разговора. Родопсин часто называют «зрительным пурпуром». Поглотив квант света, он из красного становится желтым, то есть выцветает.

История открытия зрительных пигментов началась в серрдине XIX ве

ка, когда физиолог Г. Мюллер обнаружил, что сетчатка глаза лягушки быстро выцветает на свету. Позднее Кюне в Германии впервые выделил этот пигмент и подробно исследовал его. В 30-х годах XX века лауреат Нобелевской премии Джордж Уолл определил, что молекула зрительного пурпура — это сложный окрашенный белок хромопротеид. Та его часть, .которая поглощает видимый свет, называется хромофором и состоит из альдегида витамина А (ре-тиналя). Она связана с белком — опсином.

Таким образом, родопсин интересен, с одной стороны, как вещество, в котором начинается процесс зрения, а с другой стороны — как пример типичного, классического водо-иерастворимого мембранного белка, который мы умеем выделять.

Кроме зрительного родопсина, есть еще бактериальный. Лет пять назад ученые выделили из бактерий, живущих в невероятно соленой воде, красный белок, который по своему химическому составу оказался удивительно похожим на родопсин. Первый его исследователь Стакениус даже подумал, что этот белок также выполняет зрительную функцию, что бактерии «видят». Но позже выяснилось, что белок нужен бактериям не для зрения, а для бесхло-рофильного фотосинтеза.

Итак, два сложных по своим свойствам, уникальных белка, оба мембранные, оба водоиерастворимые, оба с известной функцией, могут быть подвергнуты современному структурному химическому анализу Если удастся зто сделать, то. будет достигнута цепь, пожалуй, самого важного раздела исследований.

— Для того чтобы разобраться в сущности первичного механизма фоторецепции, необходимо подробнее рассмотреть структуру ретииаля. Что собой представляет эта молекула!

— Прежде всего отметим, что молекула ретиналя способна изгибаться, принимать разные конфигурации— как говорят химики, транс- и цис-изомеры. Источником энергии для таких изменений может служить свет. Это явление называется фотоизомеризацией.

Только один из пяти возможных изомеров ретиналя участвует в фоторецепции — 11-цис-изомер, только эта молекула может соединяться с опсином и образовывать светочувствительный зрительный пигмент — родопсин.

При поглощении кванта света хромофор молекулы зрительного пигмента (11-цис-ретиналь) фото-изомеризуется: он переходит в трансформу, выпрямляется. В ре

зультате связь с опсином нарушается. Далее трансретиналь все более отходит от опсина и, наконец, вообще отрывается от него — происходит изменение окраски зрительного пигмента из розового в желтый.

Как я уже говорил, наша основная задача — установить первичную структуру белковой цепи родопсина. Поэтому мы стремимся получить оп-син, белковую часть родопсина, в максимально чистом виде и в состоянии, наиболее удобном для выяснения последовательности аминокислотных остатков. Конечно, при очистке опсин неизбежно теряет свои биологические свойства, но это для структурных исследований на определенном этапе не имеет существенного значения.

Чтобы мембранный белок освободить от связанных с ним липидов, применяют обычно два способа: обработку органическими растворителями или особыми мылоподобными веществами — детергентами. Увы, в первом случае полученный белок вообще нельзя было расщепить на фрагменты, а во втором — только после удаления избытка детергента. Пришлось разработать методику очистки раствора опсина через ионообменные смолы Часть детергента все-таки остается с белком, однако в таком количестве, что уже не мешает ферментному гидролизу белка.

Само расщепление родопсина на крупные фрагменты, удобные для определения аминокислотной последовательности в специальных автоматических аппаратах, происходило с помощью особых ферментов-про-теиназ или химических реагентов, в частности бромциана. Он расщепляет белковые цепи там, где находятся остатки аминокислоты метио-нина. Анализ показал, что опсин содержит 8 остатков метионина. Поэтому при расщеплении родопсина бромцианом, как и следовало ожидать, образовалось 9 фрагментов. Сейчас ведутся работы по выделению и очистке этих фрагментов.

Интересно, что ряд фрагментов, выделенных при расщеплении белков зрительного и бактериального родопсинов, начинается с одного и того же аминокислотного остатка. Это указывает в какой-то мере на их сходство. Дальнейшее изучение фрагментов, по всей вероятности, покажет, насколько «сходны» эти два различных в функциональном отношении белка.

Итак, нам удалось разработать методику получения опсина и его ферментативного расщепления. Впереди — определение аминокислотной последовательности во фрагментах, а затем — и всего белка. А тогда можно будет приступить и к разгадке точного физико-химического механизма зрения.

4